角色名：绯村剑心 演员：佐藤健

本作的主角，传说中的刽子手，人称“人斩”拔刀斋。然而自维新伊始，他便立下了不杀之誓，一个人佩戴者无法杀人的逆刃刀，开始了浪客的旅程。在前作中遇见薰等人并成为伙伴。本作中为了维护和平盛世而前去击败志志雄，最后因为薰的落水而跳进大海，由师傅比古清十朗救走。流派是飞天御剑流。

角色名：神谷薫 演员：武井咲

本作女主角，内心深处爱着剑心，继承了父亲的神谷活心流，一直追剑心来到京都，却教宗次郎拐走。

角色名：志志雄真实 演员：藤原龙也

最大反派，与剑心一样是维新派的杀手，却因为自己的野心遭被政府暗杀，原本应该已经死于政府所纵之火，却凭借强大的生命力活了下来，发誓夺国。身体的排汗组织几乎完全烧坏，所以自身无法散热，因此战斗时间限于15分钟。

角色名：斋藤一 演员：江口洋介

原新选组三番队队长，擅长牙突剑，身手不凡，但是在整个系列中，真正有他出场的精彩比斗却一场也无。维新结束后改名藤田五郎，成为警察。

角色名：四乃森苍紫 演员：伊势谷友介

隐秘御庭番首领，一把鞘中藏了两把太刀。因为伙伴遇害，而想要杀死拔刀斋从而将最强的称号先给故友，故此化身修罗，将同为隐秘御庭番的老翁打成重伤，还不意教自己信赖的小操目击。

角色名：濑田宗次郎 演员：神木隆之介

因为是私生子而遭受家人的虐待，在听了志志雄“强者生，弱者死”的理念后，用志志雄送的小刀杀死了家人。因为用自己的天赋挥舞着剑，因此得名天剑，且喜怒哀乐中只有乐一种感情，更身负一种凭借蹬力而快速移动的步法：缩地。刺杀了大久保利通，与剑心交手并斩断了逆刃刀，片尾还掳走了薰。是志志雄的部…