角色名：绯村剑心 演员：佐藤健

传说中的刽子手，人称“人斩”拔刀斋。然而自维新伊始，他便立下了不杀之誓，一个人佩戴者无法杀人的逆刃刀，开始了浪客的旅程。在前作中遇见薰等人并成为伙伴。本作中为了维护和平盛世而前去击败志志雄，最后因为薰的落水而跳进大海，由师傅比古清十朗救走。流派是飞天御剑流。

角色名：神谷熏 演员：武井咲

继承教神谷活心流的年轻的代师傅，守护着去世的父亲道场。性格倔强，非常讨厌歪曲真相，充满同情心。抱着“谁都有一两个不想提起过去”的心态对剑心的过往绝口不问，担心剑心再度沦为刽子手，期望剑心能将不杀的誓言贯彻下去。剑心在前往京都以前以“到现在为止，谢谢”向熏道别，熏抱着与剑心一起战斗…

角色名：志志雄真实 演员：藤原龙也

幕府末期时来自长州派的一名维新志士。“禁门之变”之后，由剑术和绯村不相上下的他接替拔刀斋，担任“影子杀手”。但是维新派并不信任他，怕志志雄把杀手内幕公开，维新政府就可能被颠覆。于是派火枪队将志志雄击毙，然后焚尸。没有想到志志雄居然活了下来，并且开始了对维新政府的报复行动。

角色名：相乐左之助 演员：青木崇高

前赤报队准队士，以做打手为生亦以打架为乐。 从小对维新充满的希望，但是队长被维新政府以“假军官”的名义处死之后，便开始痛恨明治维新政府，更企图推翻它。在一次比武之中，他败给了绯村剑心，使他认识到明治的日本需要的是和平而不是战争，于是他也踏上了维护时代和平之路，被剑心称为最可靠的同…

角色名：高荷惠 演员：苍井优

一名来自会津的女医生。因在战乱中与家人失散，而来到东京。不料却被人禁锢起来开始制做鸦片，因而良心受到谴责，于是开始设法逃离这个是非之地。终于，她在剑心和左之助的帮助下脱离了束缚，并成为了一名优秀的女医生。

角色名：明神弥彦 演员：大八木凯斗

弥彦的父亲战死上野战争，母亲也得了重病。弥彦母子为了治病借钱， 但是弥彦母亲的病终究还是没有治好。债主为了让他还钱，就逼迫弥彦去偷钱，终于有一天，他碰到了剑心和薰，他们帮助弥彦脱离了困境，而弥彦也成了薰的首席大弟子。

角色名：斋藤一 演员：江口洋介

原新撰组第三组组长。“牙突”，“牙突零式”是斋藤的绝招，在幕末时与剑心是敌非友。 明治维新后，斋藤在东京当了一名警察，改名藤田五郎，继续贯彻他在新撰组－恶*即*斩的思想。这时候的他对与剑心之间的胜负仍十分执着，一心想和剑心分个高低。但是在危难时刻，斋藤放下私人恩怨，与剑心联手。

角色名：濑田宗次郎 演员：神木隆之介

志志雄率领部队的“十本刀”首位，侍奉志志雄时间最长的亲信。被称为“天剑宗次郎”，不仅拥有和剑心势均力敌的拔刀术速度，还拥有急速中的缩地移动术。自小生活在一个被人打骂欺负的环境里，为了生存，他只有微笑着面对困境。缺乏喜怒哀中“乐”以外的感情，因此可以什么都感觉不到一边微笑着杀人，不…

角色名：四乃森苍紫 演员：伊势谷友介

御庭番众的首领。属小太刀二刀流。 御庭番众是幕府时期的情报组织，而苍紫作为明治时御庭番众的首领，为了证明御庭番众是最强的组织，而和剑心发生了冲突。结果苍紫不敌剑心，手下四大高手全部死于非命。伤心绝望的苍紫发誓要杀死剑心，以雪前耻，捍卫御庭番众最强者的名誉。于是他与志志雄合作，处处…

角色名：卷町操 演员：土屋太凤

御庭番众的成员，性格非常开朗活泼，在四乃森苍紫误入修罗道期间，自称御头，从小喜欢四乃森苍紫。